{"id":2790,"date":"2023-02-18T21:08:00","date_gmt":"2023-02-18T21:08:00","guid":{"rendered":"https:\/\/nebfeupicbas.pt\/?p=2790"},"modified":"2023-02-18T21:50:35","modified_gmt":"2023-02-18T21:50:35","slug":"bionow-62-tiger-o-novo-passo-na-monitorizacao-da-expressao-genica","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/nebfeupicbas.pt\/?p=2790","title":{"rendered":"BioNOW! #62 – TIGER: o novo passo na monitoriza\u00e7\u00e3o da express\u00e3o g\u00e9nica"},"content":{"rendered":"\t\t
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BioNOW! #62 - TIGER: o novo passo na monitoriza\u00e7\u00e3o da express\u00e3o g\u00e9nica<\/h2>\t\t\t\t<\/div>\n\t\t\t\t<\/div>\n\t\t\t\t\t<\/div>\n\t\t<\/div>\n\t\t\t\t\t<\/div>\n\t\t<\/section>\n\t\t\t\t
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Apesar de n\u00e3o mutuamente exclusivas, a vida e as c\u00e9lulas t\u00eam uma rela\u00e7\u00e3o incontorn\u00e1vel. Assim sendo, \u00e9 \u00f3bvia a necessidade do estudo da c\u00e9lula para atingir n\u00edveis superiores de compreens\u00e3o acerca dos processos e vias em que estas se envolvem, caminhando em dire\u00e7\u00e3o ao entendimento da pr\u00f3pria vida.<\/p>

Como \u00e9 bem sabido, a express\u00e3o g\u00e9nica de uma c\u00e9lula \u00e9 um fator importante na defini\u00e7\u00e3o do seu estado de diferencia\u00e7\u00e3o, bem como a sua fun\u00e7\u00e3o. Torna-se ent\u00e3o de interesse, como j\u00e1 se tem vindo a observar nos \u00faltimos anos, o estudo deste processo atrav\u00e9s do seu intermedi\u00e1rio, o mRNA. Ao conseguir identificar e quantificar as sequ\u00eancias de mRNA presentes numa c\u00e9lula ao longo do tempo, adquire-se uma ampla quantidade de informa\u00e7\u00e3o.<\/p>

Note-se, contudo, que o mRNA n\u00e3o \u00e9 o \u00fanico tipo de RNA presente intracelularmente e, apesar de este ser pass\u00edvel de distin\u00e7\u00e3o gra\u00e7as \u00e0 sua cauda de adeninas na extremidade 3\u2019 (no que toca, obviamente, \u00e0s c\u00e9lulas eucariotas), tamb\u00e9m \u00e9 de interesse o estudo de outras variantes desta biomol\u00e9cula, com uma fun\u00e7\u00e3o regulat\u00f3ria e n\u00e3o de codifica\u00e7\u00e3o proteica.<\/p>

A quest\u00e3o que emerge ent\u00e3o \u00e9: como ser\u00e1 poss\u00edvel \u201cgravar\u201d os RNAs presentes numa c\u00e9lula? De um modo geral, e devido \u00e0 instabilidade caracter\u00edstica do RNA, este tipo de aquisi\u00e7\u00f5es de dados s\u00e3o feitos atrav\u00e9s de mol\u00e9culas de DNA. Para tal, convencionalmente, recorre-se \u00e0 transcriptase reversa. Esta enzima \u00e9 capaz de sintetizar cDNA complementar ao RNA, obtendo-se ent\u00e3o uma biblioteca cuja amplifica\u00e7\u00e3o e posterior sequencia\u00e7\u00e3o permitem determinar o RNA presente nas c\u00e9lulas analisadas. Apesar desta t\u00e9cnica, denominada de RNA-seq, ainda ser bastante utilizada, acarreta algumas limita\u00e7\u00f5es associadas \u00e0 necessidade de extrair o RNA e recorrer \u00e0 transcriptase reversa, que introduzem erros experimentais e tornam o processo moroso. Al\u00e9m disso, esta \u00e9 geralmente aplicada a estudos populacionais e n\u00e3o a c\u00e9lulas independentes.<\/p>

Assim sendo, tem havido um esfor\u00e7o da comunidade cient\u00edfica no sentido de desenvolver novos m\u00e9todos que permitam uma an\u00e1lise mais exata e direcionada do RNA intracelular. No artigo em quest\u00e3o, \u00e9 apresentado o TIGER (transcribed RNAs inferred by genetically encoded records). Como o pr\u00f3prio nome indica, este procedimento procura efetuar marca\u00e7\u00f5es gen\u00e9ticas para contabilizar o RNA alvo. Esta marca\u00e7\u00e3o n\u00e3o \u00e9 feita, contudo, no pr\u00f3prio DNA gen\u00f3mico, mas sim numa por\u00e7\u00e3o de DNA alvo de um vetor inserido.<\/p>

Resolvido o problema do registo, \u00e9 necess\u00e1rio ainda abordar o m\u00e9todo de identifica\u00e7\u00e3o do RNA propriamente dito. A respons\u00e1vel pelas altera\u00e7\u00f5es gen\u00e9ticas \u00e9 a Cas9. Para induzir modifica\u00e7\u00f5es, esta enzima tem de ser ativada por liga\u00e7\u00e3o a um gRNA (guide RNA) que, neste caso em concreto, \u00e9 o pr\u00f3prio duplex imperfeito de RNA previamente formado. Para isso, recorre-se a tracrRNA complementar aos transcritos de RNA de interesse, os quais ir\u00e3o emparelhar formando um RNA de cadeia dupla com hibrida\u00e7\u00f5es. Assim, \u00e9 poss\u00edvel, atrav\u00e9s do tracrRNA, identificar o RNA intracelular e, ap\u00f3s esse acontecimento, induzir a marca\u00e7\u00e3o do DNA alvo associado. Deste modo, ao analisar os plasm\u00eddeos obtidos, \u00e9 poss\u00edvel quantificar os RNAs de interesse no interior da c\u00e9lula analisada.<\/p>

Ap\u00f3s a verifica\u00e7\u00e3o da efic\u00e1cia desta t\u00e9cnica na quantifica\u00e7\u00e3o de uma \u00fanica sequ\u00eancia de RNA, procurou-se investigar a sua precis\u00e3o. Para tal, os autores testaram este m\u00e9todo para avaliar situa\u00e7\u00f5es com SNP (single-nucleotide polimorphism), de modo a avaliar a sua capacidade de distinguir sequ\u00eancias com muta\u00e7\u00f5es pontuais. De seguida, testou-se ainda a possibilidade de analisar v\u00e1rios RNAs alvo de uma s\u00f3 vez, inserindo v\u00e1rios tracrRNAs e DNAs alvo.<\/p>

Em ambos os ensaios os resultados obtidos foram apelativos, pelo que tudo indica que esta poder\u00e1 vir a ser uma t\u00e9cnica de elevado interesse no estudo de fen\u00f3menos complexos e associados a heterogeneidade populacional, como por exemplo os processos de movimento de plasm\u00eddeos associados \u00e0 dissemina\u00e7\u00e3o de resist\u00eancia em bact\u00e9rias.<\/p>

O TIGER distingue-se ent\u00e3o das t\u00e9cnicas previamente utilizadas pelo facto de conseguir estudar c\u00e9lulas individuais, fazendo uma an\u00e1lise quantitativa de v\u00e1rios RNAs em simult\u00e2neo, com sensibilidade ao tempo de express\u00e3o dos mesmos. \u00c9 indubit\u00e1vel o potencial desta t\u00e9cnica e o seu estudo em maior detalhe \u00e9 de elevado interesse.<\/p>\t\t\t\t\t\t\t\t<\/div>\n\t\t\t\t<\/div>\n\t\t\t\t

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Colocam-se, contudo, algumas quest\u00f5es acerca da sua efic\u00e1cia e implica\u00e7\u00f5es na c\u00e9lula. O emparelhamento do mRNA ir\u00e1 impedir a sua tradu\u00e7\u00e3o, influenciando a fun\u00e7\u00e3o da c\u00e9lula. Al\u00e9m disso, \u00e9 importante ter em conta que as pr\u00f3prias c\u00e9lulas t\u00eam mecanismos de prote\u00e7\u00e3o que visam a elimina\u00e7\u00e3o de dsRNA: n\u00e3o poder\u00e1 isto implicar a destrui\u00e7\u00e3o do gRNA antes da modifica\u00e7\u00e3o do DNA alvo? Que outras consequ\u00eancias poder\u00e1 este tipo de an\u00e1lise ter? \u00c9 importante investir no estudo deste tipo de acontecimentos, no sentido de tornar o TIGER numa t\u00e9cnica que, al\u00e9m de todas as suas val\u00eancias, n\u00e3o comprometa a integridade da popula\u00e7\u00e3o analisada.<\/span><\/p>\t\t\t\t\t\t\t\t<\/div>\n\t\t\t\t<\/div>\n\t\t\t\t

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Sabe mais em:
https:\/\/www.bio-rad.com\/en-pt\/applications-technologies\/rna-seq-workflow?ID=Q106ZUWDLBV5<\/a><\/span><\/p>

https:\/\/www.biospyder.com\/rnaseq-limitations<\/a><\/p>

https:\/\/www.nature.com\/articles\/s41587-022-01604-8<\/a><\/p>\t\t\t\t\t\t\t\t<\/div>\n\t\t\t\t<\/div>\n\t\t\t\t\t<\/div>\n\t\t<\/div>\n\t\t\t\t\t<\/div>\n\t\t<\/section>\n\t\t\t\t<\/div>\n\t\t","protected":false},"excerpt":{"rendered":"

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